LS Dye Succinimidyl Ester (SE) （LS 琥珀酰亚胺酯）

1 产品介绍

LS SE（or NHS ester）是我司生产的具有氨基反应活性的一类荧光染料。该类染料的SE基团可以与氨基基团反应生产稳定的酰胺键。相比于市面上其他同类染料，LS是稳定性更强、水溶性更好、荧光强度更优的新一代荧光染料。

2 产品货号

3 规格或纯度

1 mg

4 储存与运输

储存条件：-20 ℃ 避光保存

运输条件：冰袋运输

5 使用方法（以标记 IgG 抗体为例）

1. 实验材料

（1）IgG：IgG 不可含有能与染料反应的胺类化学物质，如氨基酸、Tris、 BSA、明胶等。如果 IgG 中含有此类化学物质，应用 pH~7.4 的 PBS 缓冲液预先透析处理。叠氮类化合物的存在不会影响标记反应。

（2）无水 DMSO

（3）NaHCO₃

（4）葡聚糖凝胶 G-25 透析柱

（5）PBS 缓冲液（pH~7.4）

（6）NaN₃

（7）BSA

2. 标记方法和步骤

（1）准备标记抗体

用 0.1 M 的 NaHCO₃ 溶液（pH~8.3）稀释抗体 ，使抗体终浓度为 2.5 mg/mL。如果产品预先用磷酸盐缓冲液稀释，如 PBS 缓冲液（不含胺基类化合物） ，那么可以直接在该缓冲液中加入约 1/10 体积 1M 的 NaHCO₃ 母液 ，使 NaHCO₃ 终浓度为 0.1 M。

注 ：蛋白浓度为 2.5 mg/mL 时 ，标记效率大概为 35% ，蛋白浓度低于 2.5 mg/mL也可用于标 记 ，但标记效率会降低。当蛋白浓度高于 5 mg/mL 时 ，标记效率可能更高。由于缓冲液和蛋白

纯度存在差异性 ，因而更精确的标记效率由实操条件决定。如果蛋白浓度过低，可以通过超滤法 进行浓缩。

（2）准备染料储存液

室温预热一管 1 μmole 的 LS SE，在管中加入 0.1 mL 的无水DMSO，充分涡旋溶解染料 ，配制浓度为 10 mM 的染料储存液。如果使用更微量的蛋白进行标记反应 ，那么染料需要稀释至更低浓度。

注 ：a. 剩余的染料储存液应于-20℃低温存放 ，以备后续使用。如果使用无水 DMSO 配制染料 储存液 ，那么染料至少可以保存一个月。

b. 染料也可以用去离子水配制 ，但是由于染料在水中会缓慢水解 ，所以水配制的储液最好现配 现用。

（3）标记反应步骤

a. 搅拌或涡旋混匀蛋白溶液 ，逐步滴加 15-25 μL 的染料储存液（ 10 mM），使染料/蛋白的摩尔比在 9:1 至 15:1 的范围内。LS SE 标记 IgG 抗体的 DOL（结合于每个蛋白分子上的染料数量）范围请参考上表。

b. 在室温下搅拌反应 1 h ，微量标记时也可在摇床上振荡孵育 1 h。

注：在进行结合反应的同时 ，进行步骤 2(4) ，平衡葡聚糖凝胶 G-25 透析柱。

（4）从反应液中分离标记蛋白

a. 用 PBS 缓冲液（pH~7.4）平衡葡聚糖凝胶 G-25 透析柱（ 10 mm ×

300 mm）。

b. 将步骤 3(b)反应溶液加入柱子 ，并用 1 × PBS 缓冲液洗脱。首先洗脱出来的着色带是染料-蛋白结合物。

注：a. 对于小规模的标记反应，为了避免过度稀释产物，可以使用超滤装置去除结合物中的自由 染料。

b. 当结合反应完成后 ，如不及时分离染料-蛋白结合物 ，可以加入 50  μL 1M 赖氨酸终止反应。 多数情况下 ，不需要此操作 ，因为剩余的未反应的染料在反应最后已经被充分水解。

3. 确定 DOL

（1）蛋白浓度的确定

抗体浓度可通过以下公式计算：

C(mg/mL) ={[A280 -(Amax × Cf)]/1.4} ×稀释因子；

a. C 是指实验收集的抗体浓度；

b. 稀释因子是指在光度测量时的稀释倍数；

c. A280 和 Amax 分别是指在 280 nm处的吸光度以及在吸收波长处的吸光度；

d. Cf 是校正因子 ，LS SE 染料的 Cf 值请参考上面表格；

注：过柱洗脱的蛋白溶液直接用于吸光度检测可能浓度过大 ，因此需要稀释到大约 0.1 mg/mL。 稀释倍数（即稀释因子）需要从起初抗体数量（比如 5 mg）以及蛋白液洗脱的总体积来进行预估。

（2）DOL 的估算 DOL 通过下式计算：

DOL=(Amax × Mwt ×稀释因子)/(ε×C)

a. Amax ，稀释因子 ，C 值在 3(1)中已经明确；

b. Mwt 是指 IgG 的分子量(150,000)；

c. ε是 LS  SE 的摩尔吸光系数，参考第一页表格；

d. 标记 LS  SE 的 IgG 抗体最适 DOL 值，请参考第一页表格，DOL 值会波动 ，但也能得到很好的实验效果。

6 注意事项

l荧光染料激发与发射波长会受到溶剂的影响，使用不同溶剂，则激发与发射波长可能会发生变化。

l标记的蛋白如需长期储 存 ， 推 荐 加 入 5-10  mg/mL  BSA 和 0.01-0.03% NaN₃ ，以防止蛋白变性和微生物滋生。放置于 4℃避光保 存。若加入了终浓度为 50%的甘油 ，可放-20℃保存。可稳定保存一年以上。

l操作过程注意避光 ，搅拌速度应适当以避免产生气泡。

l层析柱装柱时 ，尽量使柱体均匀 ，柱面平整 ，无气泡、裂隙。

l上样时注意 ，当柱顶缓冲液与凝胶平面相切时再加样品 ，洗脱时 ，当样品走至与凝胶平面相切时再加洗脱液。

l影响标记效率的其他因素还包括：温度、反应时间、pH、荧光染料与蛋白的量等 ，需注意控制。

l本产品仅限于科研，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品， 不得存放于普通住宅内。

l为了您的安全和健康 ，请穿实验服并戴一次性手套操作。