1 产品基本信息

产品名称（中文）：CaspTrace™488 Caspase-3/7 活细胞分析试剂盒

产品名称（英文）：CaspTrace™488 Caspase-3/7 Assay Kits for Live Cell

产品编号：MX1525

产品规格：25 T，100T

产品组分

2 产品介绍

CaspTrace™ 488 Caspase-3 Substrate基于caspase-3/7活力检测细胞凋亡，适用于荧光显微术和流式细胞术。相比其他基于(FLICA)分析的Caspase的荧光底物或荧光抑制剂，CaspTrace™488 Caspase-3 Substrate检测caspase-3/7活性的同时不会抑制完整细胞的凋亡过程。

Substrate由耦合Ccaspase-3/7 DEVD识别序列的荧光DNA染料组成。Substrate最初无荧光，穿过细胞膜进入细胞质，在凋亡细胞中，Caspase-3/7剪切Substrate，释放高亲和性的DNA染色，这种染料迁移到细胞核标记DNA并发出明亮的绿色荧光。因此，CaspTrace™ 488 Caspase-3 Substrate是双功能的，既可以检测Caspase-3/7活性，又可视化细胞核在细胞凋亡进行中的形态学变化。CaspTrace™ 488染色可以甲醛固定并兼容后续免疫染色实验。

CaspTrace™488 Caspase-3 Substrate提供DMSO和PBS两种溶解形式。PBS形式可用于对DMSO毒性敏感的细胞，在对DMSO不敏感的细胞类型中，添加DMSO溶解形式可增强CaspTrace™ 488的孵育染色效果。

产品特点：

l稳定性好：荧光亮度强且抗淬灭性好；

l批间差小：产品为公司自研，批间差控制的好。

适用范围：

细胞凋亡检测

3 产品参数

Ex/Em：500/530 nm（结合DNA）

4 储存与运输

储存条件：2~8 ℃避光保存

运输条件：冰袋运输

5 使用方法（仅供参考）

一、自备材料

耗材：1.5 mL 离心管

仪器：流式细胞仪

二、操作步骤

下面提供的实验步骤根据终点法检测制度。CaspTrace™ 488 Substrate也可以进行细胞长时间孵育课程研究。细胞密度、底物浓度和抑制剂浓度可能需要优化。最佳底物浓度可能在1~10 μM之间。细胞可以在培养基、PBS或其他您所选择的缓冲液中孵育底物。对于贴壁细胞，我们建议更换新鲜含有底物的培养基，以防背景的不均一性。底物孵育后换液或洗涤细胞的操作是自由选择的。

(1)对照

我们建议您设定以下对照：

1)阴性对照：不诱导凋亡的细胞。

2)阳性对照：诱导凋亡的细胞。

3)抑制剂对照：诱导细胞凋亡同时（或提前10~30 min）孵育Caspase-3/7抑制剂，最后再添加CaspTrace™ 488 Caspase-3底物。

(2)Ac-DEVD-CHO Caspase-3抑制剂对照试剂盒中的Caspase-3/7抑制剂

Ac-DEVD-CHO可以用来确认Caspase-3/7依赖于CaspTrace™ 488的荧光信号。对于抑制剂对照，抑制剂的终浓度应该至少是底物浓度的2倍（例如当使用5 μM CaspTrace™ 488底物时，Ac-DEVD-CHO浓度为10 μM）。添加底物前在室温下孵育Ac-DEVD-CHO 15~30 min，加入底物后，孵育液中继续保留抑制剂。Ac-DEVD-CHO是可逆的竞争性抑制剂。在某些细胞类型，有效的Caspase-3/7抑制剂需要使用不可逆的抑制剂，如Z-DEVD-FMK，或需要在凋亡诱导之前或诱导过程中添加抑制剂。

(3)流式细胞术

1)选择合适的方法诱导细胞凋亡，未经处理的细胞样本作为对照。

2)贴壁细胞，执行CaspTrace™ 488 Caspase-3实验前先用胰蛋白酶或其他方法消化细胞。

3)冲液重悬细胞，使细胞密度为10⁶个/mL。

4)取0.2 mL细胞悬液至流式细胞试管。

5)对照样本，用Ac-DEVD-CHO处理细胞（见上文(2)Ac-DEVD-CHO Caspase-3 抑制剂对照）。

6)200 μL细胞悬液中加入5 μL 0.2 mM的Substrate并立即混匀使底物浓度为5 μM。不同细胞的最佳底物浓度可能不同，需分析优化。

7)室温避光孵育细胞15~30 min。

8)加入300 μL培养基或PBS，流式细胞仪分析。检测绿色荧光的通道(Ex/Em：485/515 nm)。

(4)荧光显微镜

1)选择合适的方法诱导细胞凋亡，未经处理的细胞样本作为对照。

2)抑制剂对照样本，用Ac-DEVD-CHO处理细胞（见上文(2) Ac-DEVD-CHO Caspase-3 抑制剂对照）。

3)用含有5 μM Substrate的新鲜培养基或PBS对细胞进行换液（见上文(1)实验优化）。对于抑制剂对照组，抑制剂与底物一同孵育。

4)室温下孵育细胞30 min或更长时间。

5)细胞可以在含有Substrate的培养基中直接观察。对于终点分析法，PBS清洗细胞，荧光显微镜观察细胞，使用观察绿色荧光的滤片(Ex/Em：485/515 nm)。

(5)荧光酶标仪

1)贴壁细胞生长在黑色96孔板中；悬浮细胞，调整密至10⁶个/mL，0.2 mL细胞悬液分装到一孔。

2)选择合适的方法诱导细胞凋亡，未经处理的细胞样本作为对照。

注：细胞可能在管或瓶中处理，然后转移到96孔检测板。

3)抑制剂对照样本，用Ac-DEVD-CHO处理细胞（见上文(2) Ac-DEVD-CHO Caspase-3抑制剂对照）。

4)对于悬浮细胞，直接添加Substrate混匀。对于贴壁细胞，用含有5 μM Substrate的新鲜培养基或PBS对细胞进行换液（见上文(1)实验优化）。对于抑制剂对照组，抑制剂与底物一同孵育。

5)细胞可以在含有Substrate的培养基中直接观察。

6)对于悬浮细胞，轻轻摇晃重悬细胞。荧光酶标仪设置激发波长488 nm和发射波长520 nm。建议贴壁细胞使用底部采集方式。贴壁细胞密度的变化可能导致不准确的读数。

6 注意事项

l使用前请将产品瞬时离心至管底，再进行后续实验。

l细胞可以用终浓度为1 μM的Hoechst 33342染料共同染色，使细胞核产生蓝色荧光染色(Ex/Em：346/460 nm)。

lCaspTrace™ 488染色可以被甲醛固定，但与甲醇固定不兼容。

l甲醛固定的CaspTrace™ 488染色细胞可以用0.1% TritonX-100处理后进行后续染色，但处理后的染色的亮度可能会减弱。

l荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

l本产品仅限于科研，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

l为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。