1 产品基本信息

产品名称（中文）：Ready-to-use JC-1 线粒体膜电位检测试剂盒

产品名称（英文）：Ready-to-use MitoProbe JC-1 Assay Kit

产品编号：MX1523

产品组分

2 规格或纯度

20 T ,100 T

3 产品介绍

产品简介：

线粒体膜电位降低是细胞早期凋亡的一个标志，它发生在细胞膜上的磷酯酰丝氨酸外翻与Caspase水解酶激活之前。当线粒体膜通透性发生改变时，膜电位会降低，这种膜电位的改变是由于Bax二聚体的形成和Bid,Bak,Bad的激活诱导线粒体膜形成孔隙造成的，当这些促凋亡蛋白被激活时，线粒体同时也将细胞色素C释放到细胞质中。

JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位△Ψm的理想荧光探针，它可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位。在线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质中，形成聚合物，产生红色荧光；在线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，为单体，可以产生绿色荧光。通过JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变可以很容易地检测到膜电位的下降，同时也可以用JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变作为细胞凋亡早期的一个检测指标。

本试剂盒操作简单快速，可以通过流式细胞仪，荧光显微镜或荧光酶标仪进行检测，同时提供了CCCP作为诱导线粒体膜电位下降的阳性对照。

产品特点：

l信号准确：提供阳性药物做对照；

l方便快捷：染料是液体稀释，无需再溶解。

适用范围：

线粒体荧光染料

产品参数

单体Ex/Em：510/527 nm               聚合物Ex/Em：585/590 nm

分子式：C₂₅H₂₇Cl₄IN₄                  分子量：652.2

分子结构图：

4 储存与运输

储存条件：-20 ℃ 避光保存，其中B组份也可4 ℃保存。为避免反复冻融，A与C组份建议分装。

运输条件：冰袋运输

5 使用方法（仅供参考）

一、自备材料

1. 耗材：细胞培养板

2. 仪器：荧光显微镜或荧光酶标仪

二、操作步骤

1. 试剂准备

(1)配制JC-1工作液

按如下方案配置1 mL 1 ×JC-1染色工作液：

取10 µL 100×JC-1染色液，加入到890 µL灭菌的ddH₂O中，涡旋混匀，向上述混合液中加入100 µL 10×Assay Buffer，涡旋混匀，即可得到1×JC-1染色液。

注：1)配置体积可同比例扩大或缩小。

2)不建议直接用1×Assay Buffer稀释100×JC-1染色液，可能会出现沉淀。

(2)配制1×Assay Buffer

按照10×assay buffer：ddH₂O=1：9的比例配置1 ×assay buffer，如1 mL 10×assay buffer+9 mL ddH₂O。

2. 染色

开始实验之前，请确保JC-1和CCCP溶液已恢复至室温。

(1)培养板中接种细胞（悬浮细胞不要超过10⁶个/mL）。

(2)阳性对照组：把试剂盒中提供的CCCP(50 mM)推荐按照1：1000的比例加入到细胞培养液中（如终浓度为50 μM即1 μL 50 mM 的CCCP溶液加入至1 mL细胞培养液中），37 ℃孵育20 min。对于特定的细胞，CCCP的作用浓度和作用时间可能有所不同，需自行参考相关文献资料确定。

3. 对于悬浮细胞

(1)取5×10⁵个细胞，重悬于0.5 mL细胞培养液中，细胞培养液中可以含血清和酚红。

(2)加入0.5 mL JC-1染色工作液，颠倒数次混匀。细胞培养箱中37 ℃孵育20 min。

(3)孵育结束后，1000 rpm离心5 min，弃上清（注意尽量不要吸除细胞）。

(4)加入1 mL预冷的1×Assay Buffer重悬细胞，1000 rpm离心5 min，去除上清，重复一次。

(5)再用适量预冷的1×Assay Buffer重悬，用荧光显微镜观察，也可以用流式细胞仪分析。

4. 对于贴壁细胞

注：对于贴壁细胞，如果希望采用流式细胞仪检测，可以先收集细胞，重悬后参考悬浮细胞的检测方法。以下为贴壁细胞对于荧光显微镜或荧光酶标仪的检测流程。

(1)对于六孔板的一个孔，吸除培养液，根据具体实验如有必要可以用PBS或其它适当溶液洗涤细胞一次，加入1 mL细胞培养液。细胞培养液中可以含有血清和酚红。

(2)加入1 mL JC-1染色工作液，充分混匀。细胞培养箱中37 ℃孵育 20 min。

(3)孵育结束后，吸除上清，加入1 mL预冷的1×Assay Buffer，吸除上清，重复一次。

(4)加入2 mL细胞培养液，培养液中可以含有血清和酚红，用荧光显微镜下观察，也可以用荧光酶标仪检测。

5. 纯化后的线粒体

(1)0.9 mL JC-1染色工作液中加入0.1 mL总蛋白量为10~100 μg纯化的线粒体。

(2)用荧光分光光度计或荧光酶标仪检测:混匀后直接用荧光分光光度计进行时间扫描(time scan)，

(3)激发波长为485 nm，发射波长为590 nm。如果使用荧光酶标仪，激发波长不能设置为485 nm时，可以在475~520 nm范围内设置激发波长。

(4)用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察。

6. 结果分析

(1)流式细胞仪分析

对于正常细胞，在PE或PI(FL2)通道可以检测到线粒体内的JC-1红色聚集物；对于凋亡细胞，在FITC(FL1)通道可以检测到JC-1绿色单体物。

(2)荧光显微镜分析

1)采用可以同时检测荧光素和罗丹明，或者荧光素与Texas Red的双通道滤波器荧光显微镜观察细胞。

2)对于正常细胞，拥有完整的线粒体膜电位，线粒体在590 nm处发出红色荧光；对于凋亡或坏死的细胞，染料以单体形式存在，在530 nm处发出绿色荧光。

(3)荧光酶标仪分析

1)红色荧光：Ex/Em：550/600 nm；绿色荧光：Ex/Em：485/535 nm。

2)计算红绿荧光比值：与正常细胞相比，在凋亡或坏死细胞中，红绿荧光比值会降低。

表1 JC-1细胞染色条件

(4)染色效果图（图 1）

                                                                      单体          聚合物

图1 JC-1染色效果图

6 注意事项

l使用前请将产品瞬时离心，再进行后续操作。

lCalcein AM遇到湿气会分解，使用后请在-20 °C下密闭冷冻保存，防止水分进入。

l荧光染料均存在淬灭问题，实验操作时请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

l本产品仅限于科研，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品和药品，不得存放于普通住宅内。

l为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。