逆转录产物出现非特异性条带，该如何处理？

● 引物特异性差：预混液中的通用引物（Oligo (dT)₂₀VN 或随机引物）与 RNA 模板中的非目的基因序列结合，导致非特异性逆转录。解决方法：重新设计特异性更高的引物（如基因特异性引物），替换预混液中的通用引物，减少非特异性结合。

● 模板中存在杂质或基因组 DNA 污染：即使经过 37 ℃ DNase 处理，若模板初始基因组 DNA 污染严重或 DNase 活性不足，仍可能残留基因组 DNA，后续 PCR 扩增时会产生非特异性条带。解决方法：对 RNA 模板进行二次 DNase I 处理（选择非热敏感 DNase，处理后用 EDTA 失活并纯化 RNA），或在 qPCR 实验中设计跨内含子的引物，区分 cDNA 与基因组 DNA 扩增产物。

● PCR 扩增条件过于宽松：后续 qPCR 反应中退火温度过低、循环次数过多，导致非特异性扩增。解决方法：优化 PCR 扩增条件，如适当提高退火温度（根据引物 Tm 值调整）、减少循环次数（如从 40 次循环减少至 35 次），同时设置阴性对照（如无模板对照）排除污染干扰。