多数克隆不含插入片段？

(1) 相同抗性质粒污染。PCR 扩增模板为环状质粒时，如扩增产物未纯化直接用于重组反应时推荐 Dpn Ⅰ 消化，或者对扩增产物进行胶回收纯化；

(2) 克隆载体及片段中含有质粒背景。克隆载体线性化不完全，酶切制备线性化载体时，要提高快速内切酶的使用量并延长反应时间，使用胶回收纯化酶切产物；制备插入片段时尽量⽤预线化质粒作为扩增模板，扩增产物进行 Dpn Ⅰ 消化以及进行凝胶回收纯化；

(3) PCR 产物混有非特异扩增产物：优化 PCR 体系，提高特异性；胶回收 PCR 产物；鉴定更多的克隆。