假阳性/测序无信号/空载体？

(1) 质粒载体残留导致的假阳性：设置阴性对照来排查，如果阴性对照长了很多，可能是模板投入量过多或者未进行 Dpn Ⅰ  消化。若以质粒为模板 PCR 获得片段/载体：质粒投入量不宜过多（<1 ng），否则可能导致 Dpn Ⅰ 消化不完全从而造成假阳性。建议 PCR 产物进行凝胶回收纯化，纯化产物溶解在 ddH₂O 中；

(2) 挑斑方法不合适：重组产物 3' 端与 5' 端未连接，需要到感受态细胞中进行修复，斑点相对来说会小点；平板营养不均匀会导致斑点大小有差异；重组质粒相对原始质粒来说，有可能会影响细胞的生长。建议选取平板上某一块区域，同时挑选大斑和小斑，以增加挑到重组产物的概率；

(3) 菌检引物不合适：建议使用载体通用引物或者引物一端在载体上，一端在目的片段上。如果用目的片段引物进行菌液 PCR，可能会出现菌检有结果而测序无结果。