1 产品基本信息

产品名称（中文）：聚甲丙烯酸（20mM 水溶液）

产品名称（英文）：Ready-to-use PMA (20 mM in Water)

产品编号：MF1821

2 规格或纯度

100 μL

3 产品介绍

产品简介：

PMA 是一种对双链 DNA 亲和性极高的染料，自身荧光微弱，与核酸结合后荧光显著增强。因无法穿透细胞膜，它能特异性修饰膜受损的死细胞 DNA。在约 464nm 蓝光照射下，PMA 修饰的 DNA 发生光解，其光反应性叠氮基转化为高活性氮烯自由基，与 DNA 结合位点附近烃基反应，形成稳定共价氮碳键，实现 DNA 永久修饰（图 1），这使 DNA 不溶，在提取基因组 DNA 时随细胞碎片丢失，阻碍死细胞目标 DNA 的 PCR 扩增。未结合的 PMA 在强光下与水反应，分解为无交联活性的羟胺，不影响 PCR 扩增。凭借此特性，PMA 结合实时定量 PCR（qPCR）技术，可检测细菌、生物膜、酵母等多样本。与 qPCR、NGS 等技术联用，广泛应用于食品、水安全及环境检测领域。

产品特点：

l特异性高：特异性与死菌 DNA 结合，且阻碍后续的死菌基因组 DNA（gDNA）的提取与 qPCR 扩增；

l高选择性：PMA 比 EMA 更有效地与死细胞 DNA 结合，提高活死细胞区分准确性；

l应用广泛：检测多种样本类型包括细菌、生物膜、酵母、真菌、病毒和真核细胞等；

lqPCR 兼容：PMA 与 qPCR 技术更兼容，提供更可靠的活细胞数量测定；

l光稳定性：PMA 在光照下更稳定，优于 EMA。

适用范围：

核酸染料死活细菌鉴定

4 储存与运输

储存条件：-20℃避光保存；试剂盒组分含荧光染料，使用和保存时需注意避光。

运输条件：冰袋运输

5 使用方法（仅供参考）

(1) 吸取 10μL 菌液至液体 LB 培养基，放入细菌培养箱培养过夜或更久，直至细菌达到对数生长期（OD₆₀₀≈1.0）。需注意，培养基种类和培养时长可依据实验情况调整。

(2) 取两份 400μL 活细菌，分别置于洁净的离心管中。

(3) 若需死细菌作为对照（可选），可将活细菌放入水浴锅，选择 95℃加热 5 分钟，或 58℃加热 3 小时，具体依样本类型而定，处理后即得死细菌，后续操作与活细菌一致。

(4) 两份活细菌，一份不做 PMA 处理，另一份用 25μM PMA 处理（处理不同类型或来源细菌的最佳 PMA 浓度，需查阅相关文献确定）。

(5) 将经 PMA 处理的样本置于室温摇床上，避光孵育 10 分钟，让染料与样本充分混合。

(6) 对样品进行蓝光照射，照射时长需自行摸索确定。例如可使用 60W 蓝光灯照射 15 分钟；若使用卤素灯，建议将 PMA 处理后的样本管放置在距离光源 20cm 处的冰块上（冰块置于透明托盘中），调整光源直射样品，光解 5-15min；若直接使用从环境获取的细菌实验，鉴于环境样本的复杂性和浑浊度，需适当延长光解时间。

(7) 将处理和未处理的活细菌以 5000×g 的转速离心 10 分钟，去除上清液。

(8) 根据样本类型选择合适的基因组 DNA 提取试剂盒，洗脱 DNA 时，各组样本使用相同的洗脱体积。DNA 提取步骤参照所用试剂盒说明书。PMA 的作用机制之一是通过沉淀去除样本中结合的 DNA，所以提取基因组 DNA 时，各组需用相同体积的洗脱液进行体积归一化处理（由于死菌和活菌提取的基因组 DNA 量不同，两者浓度差异显著）。

(9) 按如下体系制备反应混合液：

(10) 轻柔涡旋使反应混合液均匀混合，随后转移一定体积至 PCR 管。

(11) 测试程序（根据自备 qPCR Mix 进行程序设定）。

(12) 数据分析：以活细菌和死细菌作为对照，分析计算样本中的活细胞数量。在开展 PMA 活细菌检测前，建议先对引物及 PCR 程序的适用性进行验证。

(13) 计算死、活细菌对照 dCt：

lqPCR 实验结束后，用仪器自带软件计算每个样本的 Ct 值。

l通过计算每个对照细菌的 dCt 来判断 PMA 是否成功抑制了死细菌 DNA 的扩增，计算如下：

dCt _活 = Ct_{（活, PMA 处理）}- Ct_{（活, PMA 未处理）}

dCt _死 = Ct_{（死, PMA 处理）}- Ct_{（死, PMA 未处理）}

l活细菌 dCt 预期值接近 0±1，这意味着 PMA 不会干扰活细胞 DNA 的扩增。

l死细菌的 dCt 预期值大于 4（dCt 为 4 时，代表死细菌 DNA 减少约 16 倍，即去除了 94%；dCt 为 8 时，减少约 250 倍，即去除了 99.6%）。

l死细菌的 dCt 受多种因素影响，包含菌株系 / 细胞类型、细菌致死方式、PMA 使用浓度以及扩增序列长度。

(14) 计算活细菌占比：当死、活细菌对照结果无异常，即可开展样本中活细菌占比的计算。

l样本 dCt 值的计算：

dCt _样本 = Ct_{（样本, PMA 处理）}- Ct_{（样本, PMA 未处理）}

ldCt 值转换为活细菌比例：

PMA 抑制倍数 = 2^{（样本 dCt）}

活细菌% = 100 / PMA 抑制倍数

(15) 活细菌绝对数量的计算：若要计算样本中活细菌的绝对数量，需用已知数量的目标菌基因组 DNA 绘制标准曲线。建议将几组基因组浓度稀释至 qPCR 分析体系的有效范围内。

l制作标准曲线，细胞数为横坐标，Ct 值为纵坐标。

l实验样本拷贝数的计算：

Ct = 斜率 * 细胞数 + y 轴截距 (y = mx + b)

细菌数样本 =（Ct – y 轴截距）/ 斜率

注：纯化过程中活细菌 DNA 未损失。

示例：活 / 死大肠杆菌用 25μM PMA 孵育后光解处理，然后提取 gDNA，采用 uidA 引物进行扩增（具体结果参考对应实验图谱）。

6 注意事项

1.适用范围与前期验证：PMA 能根据细胞膜的通透程度区分死菌和活菌。多数杀菌方式会破坏细胞膜，适用于 PMA 检测，但紫外线照射等可能不会立即导致细胞膜破裂，存在假阳性风险。因此在使用 PMA 检测前，须进行文献查阅和预实验，确认其适用于所选细菌种类和杀菌方法。

2.光解操作要点：对细菌进行 PMA 处理后，需进行光解，使染料与死细胞 DNA 共价结合，一般采用蓝光。光照强度越高，光解效率越好。不过，非 LED 灯（如卤素灯）照射时易使样本升温，影响分析结果，建议照射时用冰块给样品降温。

3.样本保存注意事项：样本可在光解后冷冻保存。若在 PMA 处理和光解前冷冻，可能损坏细胞膜，导致假阴性结果。若需检测前冷冻样本，应先做预实验。

4.DNA 提取与对照设置：PMA 通过沉淀去除共价修饰的 DNA。提取基因组 DNA 时，需用相同体积的洗脱液进行体积归一化。阳性对照建议选用活细胞的基因组 DNA。

5.有效性验证方法：验证 PMA 在测试样本中的有效性，可对比相同处理样本添加与未添加 PMA 时的 Ct（dCt）变化。

6.操作前准备：使用前将产品瞬时离心至管底，再进行后续实验。

7.储存与使用要求：试剂盒组分含荧光染料，使用和保存时需注意避光。

8.本产品仅限于科研用途并且不得存放于普通住宅内。

9.为了您的安全和健康，请遵循您所在常规实验室安全规定。