1 产品基本信息

产品名称（中文）：总 NO 检测试剂盒

产品名称（英文）：Total Nitric Oxide Assay Kits

产品编号：MX1533

产品规格：50 T,200 T

产品组分

2 产品介绍

NO作为重要的气体信号分子，广泛存在于生物体内和各个组织中并且参与许多生物效应和生理病理过程，NO带有自由基，这使它的化学性质非常活泼，在体内迅速氧化生成亚硝酸盐和硝酸盐混合物。本试剂盒基于Griess反应的原理，采用优化的反应条件，通过硝酸还原酶还原硝酸盐为亚硝酸盐，从而达到检测总NO含量的目的。

产品特点：

l检测精准：精准定量NO含量；

l适用范围广：可以检测的样品有细胞裂解液、组织裂解液、细胞或组织 的培养液、血清、血浆或尿液等中的一氧化氮含量。

适用范围：

NO定量

3 储存与运输

储存条件：-20 ℃ 避光保存

运输条件：冰袋运输

4 使用方法（仅供参考）

一、自备材料

1. 耗材

96孔板细胞培养板

2. 试剂

PBS

3. 仪器

多功能酶标仪

二、操作步骤

1. 样品处理

含有高浓度蛋白的样品如血清或者含有高浓度血清的细胞培养液，在加入Griess Reagent I后可能会产生沉淀。如果产生沉淀，则可将样品沸水浴加热5 min ，以变性蛋白，然后12000 g离心5 min，取上清用于后续的测定。对于细胞或组织样品可以用相应的裂解液进行裂解。对于尿液样品，通常需要用水稀释10~50倍后检测。不宜使用肝素抗凝的血浆，肝素抗凝的血浆会和Griess Reagent反应产生沉淀。

2. 标准品稀释

如果样品为血清，则可以简单地使用PBS、生理盐水等适当溶液稀释标准品。其他样品稀释标准品所用的溶液要和制备或稀释样品时所用溶液保持一致。稀释的标准品宜现配现用，不宜冻存。

把1 M NaNO₂稀释成1 μM、10 μM、20 μM、40 μM、80 μM、100 μM六个浓度。

(1)取1 M NaNO₂标准品1 µL，加到1 mL的稀释液中，得到1 mM NaNO₂溶液。

(2)取1 mM NaNO₂溶液10 µL，加到90 µL的稀释液中，得到100 µM NaNO₂溶液。

(3)取100 µM NaNO₂溶液80 µL，加到20 µL的稀释液中，得到80 µM NaNO₂溶液。

(4)取80 µM NaNO₂溶液，加入等体积稀释液中，得到40 μM的NaNO₂溶液。同样方法稀释，得到10 μM、20 μM NaNO₂溶液。

(5)取20 μM NaNO₂溶液5 µL，加到95 µL的样品所用的稀释液中，得到1 µM NaNO₂溶液。

3. 试剂的准备

(1)加约1.2 mL双蒸水或Milli-Q级纯水至2 mg NADPH中，颠倒混匀溶解后，配制成2 mM NADPH，放置冰浴上使用，余下的NADPH溶液须立即分装后-70 ℃冻存。

(2)FAD 可以适当分装后-20℃或-70℃保存 ，使用时放置在冰浴上使用。

(3)Nitrate Reductase 和 LDH 应放置在冰浴上使用（注意在使用完毕后 立即-20℃保存）。Griess Reagent I 和 Griess Reagent II 在使用前恢  复至室温。

(4)参考右侧表格依次加入标准品、样品和检测试剂并进行相应检测。

(5)根据标准品曲线计算出样品中一氧化氮的浓度。

4.标准品、样品和检测试剂

5 注意事项

l如果Griess Reagent I取出时含有沉淀，可将其置于37 ℃水浴锅中，水浴直至沉淀溶解。

l对于含有较高浓度硝酸盐的培养液，在检测一氧化氮前必须先换成其他适当培养液例如：DMEM、MEM、F12等，或换成HBSS或PBS等。因为较高浓度的硝酸盐会对本试剂盒产生干扰。

l由于检测过程中有还原反应，凡是影响还原反应的氧化或还原试剂要注意避免，例如常用还原剂DTT和巯基乙醇。

l反应必须避光进行，每次加入试剂时，需避免各检测孔中产生气泡，以免气泡干扰检测结果。

l样品的用量上限为60 μL，血清、血浆或组织匀浆液通常使用40 μL就足够了。样品不足60 μL时，不同样品之间的体积需要保持一致，体积不足的部分用制备或稀释样品时所使用的溶液补足。

l可以同时设置加入200 μL水或PBS的2~3个孔为阴性对照，这2~3个孔仅仅加入水或PBS，不再加入任何其他试剂。

l检测时，如无540 nm滤光片，520~560 nm的滤光片也可以使用。

lNADPH，Nitrate Reductase，NaNO₂，Griess Reagent I和Griess Reagent II需避光保存。

lNADPH配制成溶液后须少量分装，并放于-70 ℃保存。

l荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

l本产品仅限于科研，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

l为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。