1 产品基本信息

产品名称（中文）：5-乙炔基-2’-脱氧尿苷（EdU）

产品名称（英文）：EdU

产品编号：MX1536

产品规格：2 mg,10 mg,50 mg

2 产品介绍

EdU，即5-乙炔基-2’-脱氧尿嘧啶核苷（5-Ethynyl-2’-deoxyur idine）是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶(T)渗入正在复制的DNA分子中，通过基于EdU的乙炔基与FT™系列荧光染料标记的叠氮化物（Azide）通过一价铜离子催化下发生特异性反应，形成稳定的三唑环，该反应为点击化学反应（Click Reaction）。该反应可快速检测细胞DNA复制活性，准确检测细胞增殖能力。检测原理见图 1。

与BrdU检测方法相比，EdU检测方法用量小得多，十分之一的用量即可获得与BrdU检测试剂盒相同甚至更好的检测结果，而且小分子化学反应检测方法反应快、效率高，反应时间仅需几分钟，不需要DNA变性、蛋白酶处理、抗原抗体过夜孵育，能够更好地保护细胞形态，更简单、更灵敏、更快速、更准确。

EdU适用于各种动物活体注射，稳定性较好，对活体无明显副作用，可将目标组织制备为石蜡或冰冻组织切片后检测，也适用于体外培养的细胞增殖检测。本产品系列适用于小鼠、大鼠及其他动物模型的各种组织器官（血管除外）的细胞增殖检测。

本制品需与MX1543、MX1544、MX1545等EdU成像试剂盒配合使用。

图1 检测原理图

产品特点：

l快速高效：点击化学反应，仅需几分钟可检测细胞DNA复制活性，准确检测细胞增殖能力；

l简便、精准：不需要DNA变性、蛋白酶处理、抗原抗体过夜孵育，能够更好地保护细胞形态；

l适用性广：适用范围广，适用于细胞和各种动物活体注射；

l使用方便：可搭配我司其它试剂使用，方便灵活。

适用范围：

适用于各种动物活体注射、适用于体外培养的细胞增殖检测

3 产品参数

CAS号：61135-33-9

分子量：252.2

溶解性：可溶于DMSO、PBS或生理盐水

 分子结构图：

注：配置储液时，建议用DMSO溶解；该产品在DMSO中溶解性非常好。

4 储存与运输

储存条件：-20 ℃ 避光保存

运输条件：冰袋运输

5 使用方法（仅供参考）

自备材料

1. 耗材

(1)离心管 (2)免疫组化笔

2. 试剂

(1)无水DMSO (2)1 × PBS (pH 7.2~7.6) (3)固定剂（丙酮） (4)通透液

(0.5% Triton X-100 in PBS) (5)甲醇 (6)EdU 检测试剂(7)中性树脂

3. 仪器

荧光显微镜或流式细胞仪

操作步骤

1. 细胞裂解

(1)将转入报告基因的细胞中的培养基移除，加入PBS轻轻洗涤（贴壁细胞可直接进行此操作，悬浮细胞要离心收集细胞）。充分裂解按如下方案加入1×Lysis Buffer（用无菌水按4：1稀释A组分），然后将培养板 放在微型震荡器上室温震荡15 min ，充分裂解细胞得到裂解产物。

注：裂解产物可室温保存6 h ，-70 ℃可长期存放（裂解产物不能多次反复冻融）。

(2)将充分裂解后的裂解产物，10000~15000 rpm离心3~5 min，收上清。

一、动物 EdU 注射造模及组织切片染色

（一）实验前须知

表 1 EdU 注射液配置参考

EdU 建议初始给药量为5 mg/kg ，稀释浓度为0.5~1 mg/mL。

注：1. 可采用PBS或生理盐水稀释。

2. 注射时可将EdU注射液进一步稀释，不会影响EdU的稳定性。

 表 2 动物实验EdU标记时间及剂量参考

注：另可参考BrdU实验的注射时间，EdU 浓度按本说明书建议起始浓度或另行摸索。

（二）EdU标记

1. 动物EdU注射（具体参数可参考表 2）

(1) 注射方式：依据客户实验而定，如腹腔注射、皮下注射、肌肉注射、尾静脉注射等方式，其中以腹腔注射为多。

(2) 标记时间：最佳标记时间依据具体实验目的而定，小肠等增殖快的组织宜采用短时间标记（< 12 h），大脑等增殖慢的组织器官可能需要长时间标记（如7天或更长时间）。

(3) 标记浓度：最佳标记浓度依据具体标记时间而定，5 mg/kg剂量适合大部分实验。

(4) 取样部位：依据客户实验目的而定，一次标记可以对多种组织和器官切片，由于小肠上皮组织增殖较快，可以作为标记参考。

注：建议任何实验均可取小肠组织检测细胞增殖情况，小肠上皮组织细胞增殖速度快，成年小鼠EdU注射6 h后即可检测到阳性信息，可用作实验阳性对照进行预实验。

（三）切片处理

1. 切片前处理：组织器官最好进行清洗 ，以去除血液、组织或器官中残留的EdU ，降低背景。

2. 切片厚度 ：3~10 μm为宜，切片过厚可能影响切片背景。

3. 切片后处理：

(1) 石蜡切片处理：二甲苯脱蜡2次，每次10 min ，乙醇梯度（100%，95%，85%，75%）水合各1次，每次5 min，去离子水清洗1次，每次3 min。

(2) 冰冻切片处理：放置恢复到室温，加入适量丙酮，4 ℃固定10 min。

去除固定液，用PBS清洗3次，每次5 min。

注：建议根据实验选择合适的固定剂，若使用甲醛类固定剂进行固定，固定完成需先加入2 mg/mL甘氨酸清洗10 min，中和残留的固定液，再进行PBS清洗。

4. 将切片稍甩干，用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），稍干后在圈内加入适量通透液（0.5% Triton X-100 in PBS），覆盖样本即可，室温孵育15 min，去除通透液后用PBS清洗3次，每次5 min。

注：若在后续实验操作中发现组画笔画的圈被破坏，需及时补画。在组织固定和通透期间，配制Click-iT反应混合物（配制体系参考以下表 3中方案）。

二、EdU标记细胞

（一）EdU 储液准备

1 mg 的EdU加入396.5 μL DMSO配置成10 mM的储液。分装保存于-20 ℃。

（二）细胞标记

1. 取对数生长期细胞，以每孔4×10³~1×10⁵细胞（可根据细胞大小、生长速度以及实验处理的具体要求调整细胞数量和密度）接种于96孔板中，培养至正常生长阶段。

2. 根据实验需要进行各种药物处理。

3. 用细胞完全培养基按一定比例稀释10 mM EdU储液至合适浓度后加入细胞中，混匀；设置不加EdU处理的阴性对照组。

注：EdU的标记浓度需根据细胞类型加以调整，建议以10 μM的初始浓度进行摸索。

4. 细胞培养箱中孵育 2 h。

注：最佳孵育时间与细胞周期有关，大多数肿瘤细胞系均可采2 h的孵育时间。EdU 浓度与孵育时间相关，短时间孵育(<2 h)宜采用高浓度，如：10~50 μM；长时间孵育(>24 h)宜采用低浓度，如：1~10 μM。

（三）细胞固定及促渗

注：对于需要做细胞表面抗原标记的实验，可以考虑在完成EdU孵育后，以含3% BSA洗涤液洗涤细胞2次，在细胞固定促渗之前进行。

1. 孵育完成后，去除培养基。以1 × PBS清洗细胞两次，每次5 min，

以除去未掺入DNA的EdU残留，贴壁不牢的细胞可降低清洗强度。加入50 μL 4%多聚甲醛固定液，室温孵育20 min 后，去除固定液。

2. 每孔加入50 μL 2 mg/mL甘氨酸溶液，室温孵育5 min，中和残留的固定液。

3. 以每孔100 μL 3% BSA洗涤细胞2次。

4. 去除洗涤液，加入100 μL 0.5% Triton X-100，室温孵育10 min。

以下是使用本产品进行EdU标记后，选择MX1543、MX1544、MX1545等EdU成像试剂盒进行染色的操作方法。

三、EdU检测

注：本参考步骤每个切片使用100 µL的Click-iT反应混合物。用户可以根据自己的样本情况调整等比例减少所用的溶液体积。

（一）准备1×Click-iT EdU反应缓冲液（组分C）：10×组分C试剂以去离子水稀释10倍即可。

（二）制备一份5×的Click-iT EdU反应添加物储液（组分E）：加0.3 mL

去离子水至30 mg的E组分试管中（100 mg/mL），混匀至全部溶解。使用后，剩余储液存放在≤-20 ℃,可保存一年，溶液一旦呈现棕色，则说明有效成分降解不能再用。

注：不同规格的组分E均按照此比例加去离子水溶解为5×储液备用。

（三）准备1×Click-iT EdU缓冲液添加物：以去离子水稀释5×储液至1×,溶液应新鲜配制，当天用完。

（四）依据表3准备Click-iT反应混合物。表3要求添加的组分对于反应来说非常重要，否则反应无法有效进行。

 表 3 Click-iT 反应混合物

（五）切片样本：去除步骤一/（三）/4的PBS，加入100 μL Click-iT反应混合物（表 3）至每个切片，使反应混合物均匀覆盖切片样本。

注：染色反应液的用量要依据切片大小而定，大多数器官切片均较小，只需将染色反应液滴在待观察区域即可。

（六）细胞样本：去除促渗剂，每孔100 μL的3% BSA洗涤液洗涤2次。每孔加入100 μL Click-iT工作液，均匀覆盖细胞。

（七）室温避光孵育30 min。

（八）切片样本：去除反应混合物，用3% BSA in PBS，清洗3次。

（九）细胞样本：除去Click-iT工作液，以100 μL 3% BSA 洗涤细胞2次后，去除洗涤液，加入100 μLPBS保持细胞湿润。

（十）切片样本：（加强）加入适量甲醇清洗2次，覆盖样本即可，每次5 min。去除甲醇，加入适量PBS清洗3次，每次5 min。

注：由于某些细胞类型对染料的吸附性较高，需采用加强方式洗脱以降低染料背景。

四、DNA复染

（一）以PBS稀释Hoechst 33342（组分F）储液1：2000至1×Hoechst33342溶液，终浓度为5 µg/mL。

（二）切片样本：去除步骤三，（八）的PBS，加入100 μL Hoechst 33342溶液至每个切片，覆盖样本即可，室温避光孵育20 min（建议根据实际染色情况对染色液浓度及染色时间上下摸索）。

（三）细胞样本：每孔加100 μL 1×Hoechst 33342溶液，室温避光孵育15~30 min。

（四）去除Hoechst 33342溶液，加入适量PBS清洗3次，每次5 min。

五、封片（组织切片）

（一）石蜡切片：去除PBS，将石蜡切片依次放入75%乙醇 2 min-85%乙醇2 min-95%乙醇2 min-无水乙醇 5 min-无水乙醇5 min，进行脱水，放入二甲苯中5 min ，进行透明，最后将切片从二甲苯取出，向样本上加入中性树胶进行封片。

（二）冰冻切片：去除 PBS ，向样本上加入中性树胶进行封片。

六、成像及分析

表 4 荧光发射光谱

注：建议封片完成后立即进行荧光显微镜拍照观察；如果条件限制，可将切片避光置于阴凉干燥处暂存，尽快观察拍照。

七、染色效果图（图 2）

图 2 使用EdU对增殖的HeLa细胞进行细胞增殖分析用EdU孵育HeLa细胞2小时，然后固定、促渗并用FT™ Dye 叠氮化物和本司Hoechst 33342染色。结果是根据HeLa细胞的光散射特征通过荧光显微镜拍照得出。

6 注意事项

l使用前请将产品瞬时离心至管底，再进行后续实验。

l该产品对皮肤有不可逆损伤的可能性，请注意防护，避免吸入性风险。

l试剂保存：粉末在-20 ℃避光保存，1年有效；配置成溶液，-20 ℃避光保存，1个月有效，-80 ℃避光保存，6个月有效。

l荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

l请使用一次性手套，废液请妥善处理。

l本产品仅限于科研，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

l为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。