1 产品基本信息

产品名称（中文）：通用型 FT™ Click-iT EdU 细胞增殖检测试剂盒

产品名称（英文）：Universal FT™ Click-iT EdU Cell Proliferation Kits

产品信息

产品组分

规格：如果用于荧光显微镜检测，所能使用次数为上述各个规格的最大使用次数（针对96孔板培养的细胞），如MX1543S可检测20个孔的样品（不同容器的具体用量可参考表 2）；如果用于流式检测，所能使用次数为上述各个规格的最小使用次数，如MX1543S可检测2个样品。

2 产品介绍

细胞增殖检测是评估细胞健康程度、遗传毒性及抗肿瘤药物效果的基础实验手段。检测细胞增殖最精确的方法是BrdU法，EdU法检测试剂盒是BrdU法的革命性突破。EdU（5-乙炔基-2’-脱氧尿苷）是一种嘧啶类似物，在DNA合成期整合入DNA双链，检测基于“点击”反应，一种由铜催化的叠氮化合物和炔烃作用发生共价反应形成共价键。点击法的EdU标记增殖快速有效、易于使用，只需多聚甲醛固定和Triton X-100促渗就可以使检测试剂进入细胞，只需少量的叠氮化染料即可非常有效地标记出整合的EdU；BrdU方法需要DNA变性（如酸变性、热变性或者用DNase消化）暴露出BrdU，从而方便BrdU抗体结合。本试剂盒包含EdU法检测所需要的所有组分，可以用于体外培养细胞的增殖检测。

产品特点：

l简单高效：无需抗原抗体反应，基于小分子化学反应的检测方法简单高效，反应仅需要几分钟；

l灵敏度高：无需抗体，检测染料仅BrdU抗体的1/500，很容易扩散，即便是单个增殖细胞也能准确检测；

l快速省时：无需过夜，省却了抗原抗体反应的复杂繁琐步骤，完成整个检测周期仅需5小时。

适用范围：

细胞增殖、分化、生长与发育、DNA损伤修复、病毒复制等方面的研究

3 产品参数

荧光光谱数据：

FT™488 Azide：495/519 nm；

FT™555 Azide：555/565 nm；

FT™647A Azide：650/670 nm；

Hoechst33342：350/461 nm (bound to DNA)

4 储存与运输

储存条件：-20 ℃ 避光保存

运输条件：冰袋运输

5 使用方法（仅供参考）

一、自备材料

1. 耗材

96/24/12/6 孔培养板或培养皿

2. 试剂

(1)10 mM PBS, pH7.2~7.6

(2)4%多聚甲醛固定液（in PBS）

(3)促渗试剂（0.5% Triton X-100 in PBS）

(4)2 mg/mL 甘氨酸溶液（in ddH2O）

(5)3% BSA in PBS, pH7.2~7.6

(6)1% BSA in PBS, pH7.2~7.6

(7)ddH₂O

二、操作步骤

注 ：开封后不同组分按指定温度保存。

1. 荧光显微镜检测方法

(1)细胞培养

取对数生长期细胞，以每孔4×10³~1×10⁵细胞（可根据细胞大小、生长速度以及实验处理的具体要求调整细胞数量和密度）接种于96孔板中，培养至正常生长阶段。

(2)药物处理

根据实验需要进行各种药物处理。

(3)EdU标记

1)用细胞完全培养基按一定比例稀释EdU溶液（组分A）至合适浓度后加入细胞中，混匀；设置不加EdU处理的阴性对照组。

注：EdU的标记浓度需根据细胞类型加以调整，建议以10 µM的初始浓度进行摸索。预实验中，建议设置EdU浓度梯度，可参考表 3和表 4。

2)细胞培养箱中孵育 2 h。

注：最佳孵育时间与细胞周期有关，大多数肿瘤细胞系均可采用2 h的孵育时间，可参考表 3 。EdU浓度与孵育时间相关，短时间孵育(< 2 h)宜采用高浓度，如：10~50 μM；长时间孵育(> 24 h)宜采用低浓度，如：1~10 μM；也可参考表 5。

(4)细胞固定及促渗

注：对于需要做细胞表面抗原标记的实验，可以考虑在完成EdU孵育后，以含3% BSA 洗涤液洗涤细胞2次，在细胞固定促渗之前进行。

1)孵育完成后，去除培养基。以1× PBS清洗细胞两次，每次5 min，以除去未掺入DNA的EdU残留，贴壁不牢的细胞可降低清洗强度。加入50 μL 4%多聚甲醛固定液，室温孵育20 min后，去除固定液。

2)每孔加入50 μL 2 mg/mL甘氨酸溶液，室温孵育5 min，中和残留的固定液。

3)以每孔100 μL 3% BSA洗涤细胞2次。

4)去除洗涤液，加入100 μL 0.5% Triton X-100，室温孵育 10 min。

(5)EdU检测

注 ：本参考步骤每个样本使用100 μL的工作液，用户可以根据自己的样本情况调整用量。

1)配置1×Click-iT EdU反应缓冲液（组分C）：用ddH₂O将组分C稀释10倍。

2)配置5×Click-iT EdU缓冲液添加物（组分E）：加300 μL的ddH₂O至30 mg的E组分管中（终浓度100 mg/mL），混匀至全部溶解。请注意适当分装后，-20ºC保存。如果溶解后有白色物质析出，请上下颠倒多次，待全部溶解后使用。如果该溶液颜色变成棕色，说明该组分的有效成分已失效，请弃用。

注：不同规格的组分E均按照此比例加ddH₂O溶解，制备成5×储液备用。

3)准备1×Click-iT EdU缓冲液添加物：用ddH₂O稀释5×Click-iT EdU缓冲液添加物至1×,溶液应现配现用。

4)依据表 1 准备Click-iT工作液（工作液须在配制后15分钟内使用）。

表 1 Click-iT工作液

5)去除促渗剂，每孔100 μL的3% BSA洗涤液洗涤2次。

6)每孔加入100 μL Click-iT工作液，均匀覆盖细胞。

7)室温避光孵育30 min。

8)除去Click-iT工作液，以100 μL 3% BSA洗涤细胞2次后，去除洗涤液，加入100 μL PBS保持细胞湿润。如其他无特别要求，即可进行拍照分析。

(6)DNA复染（可选）

1)用100 μL PBS洗涤细胞1次，去除洗涤液。

2)用PBS将Hoechst 33342（组分F）稀释2000倍。

3)每孔加100 μL 1×Hoechst 33342溶液，室温避光孵育15-30 min。

4)去除Hoechst 33342 溶液，用100 μL PBS洗涤细胞2次。

(7)成像及分析

建议染色完成后立即进行荧光显微镜拍照观察；如果条件限制，请于4 ℃条件下避光湿润保存3天之内完成拍照。

2. 流式细胞仪检测方法

(1)细胞培养

每孔1×10⁵~3×10⁶个细胞接种于6孔板中。

(2)药物处理

根据实验需要进行各种药物处理。

(3)EdU标记细胞

1)用细胞完全培养基按一定比例稀释EdU溶液（组分A）至合适浓度后加入细胞中，混匀；设置不加EdU处理的阴性对照组。

注：EdU的标记浓度需根据细胞类型加以调整，建议以10 µM的初始浓度进行摸索。预实验中，建议设置EdU浓度梯度，可参考表 3 和表 4。

2)细胞培养箱中孵育2 h。EdU孵育细胞的时间可以直接用作测定细胞DNA合成的指标，时间点选择以及孵育的时间取决于细胞生长速率。通过短暂的EdU孵育进行的脉冲式标记细胞可以用于研究细胞周期动力学。

注：最佳孵育时间与细胞周期有关，大多数肿瘤细胞系均可采用2 h的孵育时间，可参考表 3。EdU浓度与孵育时间相关，短时间孵育（< 2 h）宜采用高浓度，如：10~50 μM；长时间孵育（> 24 h）宜采用低浓度，如：1~10 μM；也可参考表 4。

(4)细胞固定及促渗

注：对于需要做细胞表面抗原标记的实验，可以考虑在完成EdU孵育后，以含 1%BSA洗涤细胞2次，在细胞固定促渗之前进行。

1)孵育完成后，收集细胞，每管加入1 mL PBS清洗细胞，1000 rpm 离心5 min，吸弃上清，以除去未掺入DNA的EdU残留。

2)每管加入1 mL 4%多聚甲醛固定液重悬细胞。

3)室温孵育20 min，1000 rpm离心5 min，吸弃上清。

4)每管加入1 mL 2 mg/mL甘氨酸孵育5 min，中和残留的固定液，1000 rpm离心5 min，吸弃上清，每管加入1 mL PBS清洗1次，1000 rpm离心5 min，吸弃上清。

5)每管加入1 mL 0.5% Triton X-100促渗液重悬细胞，室温孵育10 min。

(5)EdU检测

注：针对6孔板样本可参考每孔1 mL的工作液来进行，用户可以根据自己的样本情况调整用量。

1)配置1×Click-iT EdU反应缓冲液：用ddH₂O将组分C稀释10倍。

2)配置5×Click-iT EdU缓冲液添加物（组分E）：加 300 µL ddH₂O至30 mg的组分E试管中（终浓度100 mg/mL），混匀至全部溶解。请注意适当分装后，-20ºC 保存。如果溶解后有白色物质析出，请上下颠倒多次，待全部溶解后使用。如果该溶液颜色变成棕色，说明该组分的有效成分已失效，请弃用。

注：不同规格的组分E均按照此比例加ddH₂O溶解为5×储液备用。

3)准备1×Click-iT EdU缓冲液添加物：以ddH₂O稀释5×Click-iT EdU缓冲液添加物储液至1×,溶液应现配现用。

4)依据表 2 准备Click-iT工作液（工作液须在配制后15分钟内使用）。

表 2 Click-iT 工作液

5)1000 rpm离5 min，吸弃上清，去除促渗剂，每管加入1mL的1% BSA洗涤液洗涤2次，1000 rpm离5 min，吸弃上清。

6)每管加入1 mL Click-iT工作液，混匀。

7)室温避光孵育30 min。

8)1000 rpm离心5 min，吸弃染色反应液，每管加入1% BSA洗涤细胞2次，1000 rpm离心5min，吸弃上清，用1 mL 1% BSA 再次重悬细胞（重悬细胞的溶液体积可根据细胞的数量加以调整），流式细胞仪检测。

注：如需进行其他标志物检测可参考步骤 4。

(6)DNA复染

1)用100 μL PBS洗涤细胞1次，去除洗涤液。

2)用PBS将Hoechst 33342（组分F）稀释2000倍。

3)每孔加100 μL 1×Hoechst 33342溶液，室温避光孵育15~30 min。

4)去除Hoechst 33342溶液，用100 μL PBS洗涤细胞2次。

(7)细胞内抗原标记（可选）

1)加入抗体工作液，混匀。

2)避光条件下，以合适的温度及时间孵育抗体。

(8)流式检测及分析

1)建议染色完成后立即进行流式检测；如果条件限制，请避光4 ℃湿润保存待测，但不应超过3天。

2)检测的细胞数量建议尽量能达到百万级，若细胞数量较少，检测的细胞数量可调整为十万级起始进行实验。对于细胞得率过少（刚到万级）的情况，可能不利于做流式图，对此可适当减少步骤（五）8中的清洗次数。

3. 结果展示

(1)图 1 使用EdU对增殖的HeLa细胞进行细胞增殖分析

用EdU孵育HeLa细胞2小时，然后固定、促渗并用FT™ Dye叠氮化物和本司Hoechst 33342染色。结果是根据HeLa细胞的光散射特征通过荧光显微镜拍照得出。

(2)图 2 使用EdU对增殖的HeLa细胞进行细胞周期分析

用EdU孵育HeLa细胞2小时，然后固定、促渗并用FT™ Dye叠氮化物和本司 Hoechst 33342染色。细胞周期的不同区段可通过DNA含量和EDU结合。结果是根据HeLa细胞的光散射特征通过流式细胞仪画门分析得出的。

(3)图 3 使用EdU对增殖的HeLa细胞进行细胞增殖分析

用EdU孵育HeLa细胞2小时，然后固定、促渗并用FT™ Dye叠氮化物染色。结果是根据HeLa细胞的光散射特征通过流式细胞仪画门分析得出的。

附录

表 3 EdU 培养基及染色反应液的参考使用量

表 4 EdU 的参考孵育时间

注：1. EdU孵育时间取决于细胞周期，一般为细胞周期的1/10至1/5，但大多数细胞系均可采用2 h孵育时间。

2. 考虑到细胞培养基、温度、湿度、光线等其他因素的影响，细胞周期会有所变化。

表5 文献中EdU孵育浓度及时间

6 注意事项

l使用前请将产品瞬时离心至管底，再进行后续实验。

lEdU (10 mM)首次使用时建议根据实验需要分装，-20ºC 保存。

lClick-iT EdU缓冲液添加物溶液首次配制时建议根据实验需要适当分装，-20ºC 保存。如果溶解后有白色物质析出，请上下颠倒多次，待全部溶解后使用。如果该溶液颜色变成棕色，说明该组分的有效成分已失效，请弃用。

l可设置未进行EdU处理的细胞经FT™ Dye Azide染色作为阴性对照样品，用于确定合适的检测条件，此设置对干流式细胞术检测尤为重要，可以明确阴性信号的强度以划分阴性信号跟阳性信号的界限。

l本品不建议与TUNEL试剂盒同时检测。这是由于EdU的结构中有-OH存在，会影响TUNEL的反应过程。

l本产品属于铜离子催化的点击反应，可能会造成部分荧光蛋白或荧光染料淬灭，建议在点击反应完成后进行反应和检测，目前已确定受影响的染料有PE及PE tandems染料。

l铜离子会影响GFP、RFP、mCherry等荧光蛋白的荧光，因此本产品不适用于带GFP、RFP、mCherry等荧光的细胞检测。

l由于铜离子会破坏肌动蛋白结构，影响鬼笔环肽检测，所以Phalloidin (鬼笔环肽)与本产品不兼容，推荐使用Tubulin-Tracker Red (MX1404)进行细胞微管的检测。

l开封后的组分保存条件请按照说明书上进行保存。

l荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

l本产品仅限于科研，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

l为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。