1 产品基本信息

产品名称（中文）：Calcein AM/EthD-Ⅰ 活死细胞双染试剂盒

产品名称（英文）：LiveDead Viability/Cytotoxicity Plus Assay Kits for Animal Cells

产品编号：MX1529

产品规格：30 T，150 T，300 T

产品组分

注：本试剂盒次数是按照流式细胞仪一个样品使用0.5 mL工作液规定的。注意Calcein AM容易水解，需密封干燥保存，稀释工作液需当天配制。

2 产品介绍

LiveDead动物细胞活力/毒性检测试剂盒（Calcein AM, Eth D-I）是一种为动物细胞死活检测提供双荧光染色的试剂盒。试剂盒内的两种探针可分别测定细胞内酯酶活性和质膜完整性从而反映细胞活力，与相同作用的台盼蓝相比，更快捷安全且灵敏度更高。

本试剂盒可用于荧光显微镜、流式细胞仪、酶标仪以及其他荧光检测系统应用于大多数的真核哺乳动物细胞，包括贴壁细胞核的某些组织，但不适用于真菌和酵母。

产品特点：

l稳定性好：荧光亮度强且抗淬灭性好；

l批间差小：产品为公司自研，批间差控制的好；

l使用方便：我司提供多种细胞活力检测染料，选择灵活方便；

l安全灵敏：与相同作用的台盼蓝相比，更快捷安全且灵敏度更高。

适用范围：

鉴别活细胞和死细胞

3 产品参数

Calcein AM Ex/Em：494/517 nm

EthD-I Ex/Em：528/617 nm（结合DNA）

光谱图：

4 储存与运输

储存条件：-20 ℃避光保存

运输条件：冰袋运输

5 使用方法（仅供参考）

1. 荧光显微镜检测

(1)准备工作液

准备2 μM Calcein AM 和4 μM Eth D-I的染色工液：取出Calcein AM和Eth D-I原液，使其恢复室温。将20 μL 2 mM Eth D-I和5 μL 4 mM Calcein AM与10 mL PBS或其他无血清缓冲液或培养基混合，涡旋混匀。上述工作液可直接用于细胞染色。

注：Calcein AM的水溶液易水解，应当天用完。Calcein AM和EthD-I的浓度选择依据所用细胞类型不同而有所区别，推荐浓度范围为0.1~10 μM。

(2)准备细胞并开展实验

1)对于贴壁细胞，可用1×PBS清洗2~3次后进行染色。对于悬浮细胞，250~1000×g室温离心5 min，收集细胞染色。

2)用1×PBS充分清洗细胞2~3次，以充分去除残留的酯酶活性。

3)对于贴壁细胞，加入足够量的Calcein AM/Eth D-I染色工作液。对于悬浮细胞，加入适量的染色工作液，使细胞密度控制在1~5×10⁵/mL。

4)室温避光孵育15~20 min（如果工作液浓度较高或者孵育温度较高，应适当地减少孵育时间）。

5)荧光显微镜下观察标记的细胞。

2. 流式细胞仪检测

(1)取出试剂，恢复至室温。

(2)准备2 μM Calcein AM和4 μM Eth D-I的染色工作液：取出Calcein AM和Eth D-I原液，恢复至室温。将20 μL 2 mM Eth D-I和5 μL 4 mM Calcein AM与10 mL PBS或其他无血清缓冲液或培养基涡旋混匀。工作液可直接于细胞染色。

(3)用1×PBS充分清洗细胞2~3次。

(4)用0.5 mL染色工作液悬浮细胞，控制细胞密度为1~5×10⁵/mL。

注：推荐准备两管额外的细胞样品，每管只加入一种染料（Calcein AM和EthD-I），用于流式单染的补偿调节；另准备一管仅含缓冲液（该缓冲液与配制Calcein AM及EthD-I检测工作液的缓冲液宜保持一致）的细胞样品用作流式检测时的阴性对照。

(5)温避光孵育15~20 min。

(6)在1~2 h内，通过流式细胞仪检测细胞活性。Calcein AM可以由488 nm激光激发，检测荧光发射光谱约在530 nm处，Eth D-I发射光谱约在610 nm处。

注：细胞圈门时，注意排除细胞碎片，使用单染管调节补偿，双染管流式检测应获得两个相对独立的细胞群：显示绿色荧光的活细胞群和红色荧光的死细胞群。

3. 酶标仪检测

(1)在96孔黑色酶标板中培养适量的贴壁或悬浮细胞。

注：用1%的皂苷或0.1~0.5%洋地黄皂苷处理细胞10 min，即可得到死细胞。

(2)准备2 μM Calcein AM和4 μM Eth D-I的染色工作液：取出Calcein AM和Eth D-I原液，使其恢复室温。将20 μL 2 mM Eth D-I和5 μL 4 mM Calcein AM 10 mL PBS或其他无血清缓冲液或培养基混合，涡旋混匀。

注：1)10 mL的染色液足够染色一个96孔板，可根据实验需要调整染色液的体积。Calcein AM和EthD-I的浓度可在0.1~10 μM之间摸索。

2)Calcein AM的水溶液易水解，应当天用完。Eth D-I工作液可保存在-20℃,至少可保存一年。

(3)用1×PBS充分清洗细胞，以充分去除残留的酯酶活性。

对于贴壁细胞，每孔加100 μL PBS清洗细胞。对于悬浮细胞，加100 μL PBS重悬细胞，离心去上清。重复上述操作。

(4)每孔中加入100 μL PBS。

(5)每孔中加入100 μL染色工作液，使每孔总体积为200 μL，Calcein AM的终浓度为1 μM，Eth D-I 的终浓度为2 μM。轻轻摇晃培养板，使液体均匀覆盖细胞。

(6)室温避光孵育30~45 min。

注：不同的细胞最佳孵育时间有所不同，以30 min作为初始孵育时间，后续可以根据实际染色 效果对染色时间进行适当调整和优化，以得到更加理想的染色效果。

(7)酶标仪检测。当酶标仪设置为Fluorescein时，可以检测Calcein AM；当酶标仪设置为Rhodamine或TexasRed时，可以检测Eth D-I。根据光谱特性选择最佳的发射及激发波长。

注：通过对比样品组与对照组测量的Relative fluorescence values (RFU)，可以得出死细胞与活细胞数量的变化。下面也提供了另一种数据分析的方法。

4. 计算某个区域活细胞与死细胞的比例

下面方法可以计算出死细胞与活细胞的比例。需要的样品有死细胞对照组、活细胞对照组及要测的样品组。用1%的皂苷或0.1~0.5%洋地黄皂苷处理细胞10 min，即可得到死细胞。

(1)准备染色工作液及按上述步骤染色细胞。另外，分别准备1 mL 2 μM Calcein AM和4 μM Eth D-I溶液，按照下列指示来染色对照组。对 于下面组别的细胞或无细胞组，需要保持细胞数量、检测工作液浓度、孵育时间和孵育温度的完全一致。

(2)样品组及对照组测量：

A. 样品组在645 nm的测量值，记为Calcein AM和Eth D-I = F (645) sam。

B. 样品组在530 nm的测量值，记为Calcein AM和Eth D-I = F (530) sam。

C. 死细胞Eth D-I单染对照组在645 nm的测量值，记为Eth D-I = F (645) max。

D. 死细胞Calcein AM单染对照组在645 nm的测量值，记为Calcein AM = F (645) min。

E. 活细胞Eth D-I单染对照组在530 nm的测量值，记为Eth D-I = F (530) min。

F. 活细胞Calcein AM单染对照组在530 nm的测量值，记为Calcein AM = F (530) max。

G. 没有细胞的空白对照孔（加染料或不加染料均可），530 nm处的检测值记为F(530) 0。

H. 没有细胞的空白对照孔（加染料或不加染料均可），645 nm处的检测值记为F(645) 0。

(3)根据测量数据计算死细胞与活细胞的比例：

% Live Cells = (B - E) ÷ (F - E)

% Dead Cells = (A - D) ÷ (C - D)

5. 确定某个区域活细胞与死细胞的比例

通过制作530 nm和645 nm处的荧光光谱标准曲线，可以确定死细胞与活细胞的数量，每个染料的荧光强度分别与样品中死细胞或活细胞的数量成直线型关系。

6. 染色效果图（图 1）

图1 HeLa诱导凋亡处理后Calcein AM、EthD-I双染结果图

6 注意事项

l使用前请将产品瞬时离心至管底，再进行后续实验。

l酚红或血清对于本试剂盒的检测有一定的干扰。

l荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

l本产品仅限于科研，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

l为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。