E组分易挥发，请每次使用完毕后尽快保存至-20 ℃密封保存，减少E组分的挥发。

本底物是我们公司自主合成的，不同批次间存在批间差，这是正常现象。

(1)荧光素酶的表达水平与启动子活性相关，正常表达水平下检测到的荧光值应在 105 数量级左右，若检测到的荧光值比较低或无荧光值，可从启动子活性、转染效率、检测过程这几方面进行考虑。

(2)转染效率低。

1)优化转染实验条件，用较易转染的质粒做阳性对照（如转染过表达荧光蛋白质粒）；

2)确保转染 DNA 的质量，可通过酶切或琼脂糖凝胶电泳的方法对 DNA 质量进行鉴定；3)选择活性较高，处于指数分裂期的细胞进行转染。

(3)启动子活性低或诱导失败。

1)转染后的细胞培养使用特异性诱导启动子的条件；

2)优化细胞的培养条件，提高荧光素酶的表达量；

3)更换强启动子（如 SV40、CMV）。

4)海肾荧光素酶基因作为内对照，其表达应不受时期、部位、环境影响，因此常用组成型表达的TK 启动子。

(4)样品裂解效率低。

1)细胞培养时间不宜过长，12~36 h 内最好，长时间培养后，细胞可能会难裂解。

2)加入的裂解液需足量，保证细胞能够充分裂解。

(5)检测过程操作不规范。

1)选择合适的检测仪器，能够检测化学发光或者生物发光的仪器都适用于该实验；

2)需加入足量底物，保证底物的饱和，否则会造成检测结果出现很大偏差；

3)室温反应。反应时各个组分（细胞裂解产物 ，底物工作液等）都需要调整到室温；

4)荧光素酶的半衰期一般约 30 min，加完底物后可立即检测，尽量在 30 min 内完成。

(6)底物氧化失效。

1)底物避光密封保存，萤火虫荧光素酶底物-20 ℃保存；海肾荧光素酶底物推荐-20℃保存；

2)反应工作液建议现用现配。

(1)荧光值过高可能会超出仪器检测范围，从而检测不到值。

(2)减少质粒转染量。

(3)细胞样品裂解后，离心取上清后检测或对裂解产物进行稀释后检测。

(4)不建议通过减少底物量来降低荧光值，需要保证底物的饱和来反映荧光素酶真实的表达水平，否则会造成检测结果出现大的偏差。

(1)为取得最佳测定效果，在用单管的化学发光仪测定时，样品和测定试剂混合后到测定前的时间应尽量控制一致；使用具有化学发光测定功能的多功能荧光酶标仪时，宜先把样品全部加好，然后用排枪统一加入萤火虫萤光素酶检测试剂。

(2)由于温度对酶反应有影响，所以测定时，样品和试剂均需达到室温后再进行测定。

(1)萤火虫报告基因质粒原则上含有 luc 基因就可以，但是不同实验 所需的载体有一定差异，

如果您要自己构建载体，要注意有些载体没有启动子，需要自行插入启动子，如 pGL3 Basic。(2)海肾报告基因质粒尽量选择中等强度的启动子，如 TK 启动子等，不要选择强启动子 CMV、SV40等。海肾基因的表达活性应显著高于背景组，同时不干扰萤火虫萤光素酶报告基因的表达。

(3)报告基因表达载体可选择分别带有萤火虫萤光素酶报告基因和海肾萤光素酶报告基因的两个表达载体共转染，若海肾萤光素酶作为内对照，构建对照载体，那么萤火虫萤光素酶作为实验组，构建实验载体，共转染时，实验载体：对照载体组合之比可以在 10 ：1~100 ：1（或更大）是可行的。或者也可选择一个表达质粒（可同时表达萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶，但二者的表达分别由不同的启动子控制表达），选择表达量相对弱的作为内对照。

为防止孔间干扰，建议使用白色不透光孔板。黑色不透光孔板也可使用，但相较于白色不透光板测得的萤光值会低。

Luminescence，350~700 nm，建议检测时间设为 2~10 s。请注意不是吸光度(Absorption)板块。